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ELISA試劑盒實(shí)驗-如何選擇*化的包被條件？

1.包被抗原的選擇
包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類.天然蛋白需經(jīng)純化才能用直接吸附法包被,對于含雜質(zhì)較多的抗原可以采用間接捕獲法包被(先用能夠與目的抗原反應(yīng)的物質(zhì)如抗體直接吸附在酶標(biāo)板上,再通過特異性反應(yīng)使抗原固相化).ELISA試劑盒經(jīng)純化的重組蛋白一般皆可直接包板.小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機(jī)化合物,由于分子量太小,往往難于直接吸附在酶標(biāo)板上,一般都先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如BSA等偶聯(lián),偶聯(lián)物吸附于固相載體上.

2.包被液的選擇
一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液,如果包被的抗原在堿性條件下不穩(wěn)定的話,也可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液.

3.包被溫度的選擇
通常是4-8度條件下過夜或者37度保溫2小時,我們強(qiáng)烈建議4-8度條件下包被,有利于蛋白活性的保持.

4.包被濃度的選擇
包被的zui適濃度隨固相載體和包被物的性質(zhì)變化,一般蛋白質(zhì)的包被濃度為1-5ug/ml,要明確針對特定包被抗原的zui適包被濃度需要通過實(shí)驗來確定.

包板后需要封閉嗎？應(yīng)該選擇什么樣的封閉體系？
封閉是否必要,取決于ELISA試劑盒的模式及具體的實(shí)驗條件.一般說來,雙抗體夾心法,只要酶標(biāo)記物是高活性的,操作時洗滌*,不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果.而在間接法測定中,封閉一般是*的.
常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉,AbMART推薦使用5%脫脂奶粉,價廉而且封閉能力強(qiáng),不過5%脫脂奶粉只適合短期內(nèi)使用,不宜長期保存,所以試劑盒中較少使用.